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SMN1基因外显子缺失检测试剂产品审评现状

发布时间:2018-10-24
浏览次数:126

       脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传病,居儿童致死性常染色体隐性遗传病的第2位。位于染色体5q11.2~q13.3上的运动神经元存活基因(Survivalmotorneuron,SMN)是SMA的主要致病基因。

  人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2,两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因,该基因突变可导致SMA发病,SMN2为临床表型的调节基因,影响病情的严重程度,其拷贝数增加可减轻SMA表型。目前已知约94%的SMA患者为SMN1基因第7和(或)第8外显子纯合缺失所致,少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

  SMN1基因外显子缺失检测的意义

  SMA在人群中的发病率为1/5000~1/10000,群体携带者频率为1/35~1/50,是出生缺陷的高危因素,因此极有必要进行SMA携带者的人群筛查,并通过产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生率。

  临床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,即婴儿型、中间型和少年型,严重程度依次递减。神经专科医生一般根据患者发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断,辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检,结合家族史和SMN1基因分析可进行确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失,因此,SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异性。且对不同型的SMA患者,SMN1纯合缺失率没有显著差异,所以,SMN1纯合缺失的检测对于不同型SMA患者具有相同的临床诊断价值。在欧美人群中,SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断SMA的首选方法。

  SMN1基因缺失检测试剂的现状

  目前,SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏,临床检验实验室较为公认的方法是PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法。但该方法操作较为繁琐,且重复性差,不利于标准化,不易推广。同时,这种方法只能检测出纯合缺失,无法确认杂合缺失。

  荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分析,因此既可检测纯合缺失,亦可确认杂合缺失。在国内外已有多篇文献报道采用该方法进行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产品目前仍为“仅用于研究”的试剂,尚未按照体外诊断类医疗器械上市(98/79/EC)。

  2015年底,原国家食品药品监管总局批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法,以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基因,对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检测,用于SMA患者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于排除高同源性基因SMN2的干扰,特别是对于SMN2高拷贝数的受试者,需保证结果的准确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系统整合,并在反应体系中加入特定化学组分,以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T)的错配,增加PCR扩增的特异性,从而有效控制SMN2基因非特异性扩增对检测结果的影响,准确检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺失情况。

  鉴于国内外尚无任何按照体外诊断试剂批准上市的SMA分子诊断产品,因此临床试验方案中依据EMQN关于《SMA分子诊断最佳实践指南》,采用了国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试验共完成1069例,其中正常对照组777例,SMA病例组292例,统计分析结果显示申报产品与对比方法检测结果的一致性为100%(95%置信区间:99.66%~100%)。此外,9747例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分布范围的调查亦显示,该产品的纯合突变判断界值设置合理。

  该试剂目前批准的预期用途仅包含纯合缺失的检测,尚不能用于杂合缺失的检测,因此无法用于SMA携带者的筛查,这是该产品的缺陷之一。

  事实上,该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测,其检测原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差(△Ct_s),与正常对照品三个梯度稀释品中目标外显子荧光信号Ct值和内参基因荧光信号Ct值之差的平均值(△Ct_a)之差,即△△Ct,作为待测样本中目标外显子拷贝数检测变量(△△Ct=△Ct_s-△Ct_a)。根据实时荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量△△Ct的计算公式,依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct理论值(或范围);再结合目标外显子与内参基因扩增效率差异以及SMN2不同拷贝数的影响,可对上述△△Ct理论值进行优化。结果显示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值(或范围)之间可设置合理的判断界值,因此理论上该产品可分别检测出三种基因状态。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透彻,再加上缺乏可判定杂合缺失的对比方法等其他困难,本次注册申请的预期用途仅限于检测纯合突变,即SMA患者辅助诊断。

  综上,SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者筛查中具有重要的临床价值。然而到目前为止,受到技术水平的限制,相关的体外诊断试剂比较缺乏,特别是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失检测,尚无适合的体外诊断试剂上市。(器审中心审评六部  何静云)

来源:中国医药报

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